IP-10SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用

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'IP-10SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用'
中山大学硕士学位论文IP-10 SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用姓名:胡玲玉中请学位级别:硕士专业:外科学指导教师:胡作军20100519IP-10 SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用专业名称:外科学硕士研究生:胡玲玉导 师:胡作军副教扌中文摘要研究背景血管再狭窄是限制血管成形术远期疗效的主要原因,是一系列复杂的病理生理过程联合作用的结果,以血管平滑肌细胞扩增、迁移为主要病理特征。研究表明,IP?10可能具有潜在的促进血管平滑肌细胞扩增和迁移的作用,在动脉粥样硬化形成的过程中,血管壁细胞IP-10的高表达在活化T细胞的募集和定植中发挥了作用,粥样斑块的内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞均有IP?10的高表达。在同种异体移植物的血管病变中,IP?10的高表达促进了以免疫介导的平滑肌细胞扩增为特征的血管病变的发生。针对血管再狭窄的病理基础,我们试图将IP?10作为新的靶点,运用具有高效、高特异性的RNA干扰技术,沉默其在血管平滑肌细胞中的表达,研究其在血管平滑肌细胞扩增过程中发挥的作用,并进一步研 究其在体内血管再狭窄复杂过程中发挥的作用。目的研究RNA干扰技术沉默IFN??诱导蛋白10 (IP-10)基因后对血管平滑肌细胞增殖的影响,探讨IP-10在血管损伤后内膜过度增生过程中发挥的作用。方法1、根据GeneBank报道的IP?10核酸序列和SiRNA设计原则,设计并合成针对IP?1O的2条小干扰RNA,构建针对IPJ0的SiRNA表达质粒pSilence 2.0-U6,并进行酶切鉴定和测序;2、原代培养血管平滑肌细胞,将构建好的IP?10 SiRNA真核表达质粒转染入原代培养平滑肌细胞中,RGPCR及Western blot检测细胞IP?10表达,MTT法检测细胞增殖速率;3、球囊扩张加高胆固醇饮食构建新西兰兔左颈总动脉内膜损伤模型,将IP?10SiRNA局部转染入损伤血管,分别于转染后1周和4周末取标本,RT-PCR^O 免疫组化检测IPJ0表达;HE染色观察血管形态,比较血管内膜中膜比;电子显 微镜观察血管内膜增生状态。结果1、 酶切结果显示重组质粒插入片段大小与预期相符,测序结果证实该重组 质粒序列与所设计序列完全一致,表明针对HM0的SiRNA真核表达质粒构建成 功。2、 IP?10 SiRNA转染后48小时,细胞IP?10表达与未转染组比较明显降低,细胞生长速度减慢(PV0.05)。3、兔颈总动脉转染IP-10 SiRNA 一周和四周后,IP-10局部表达较未转染组 明显降低。4周时,转染组血管内膜中膜比较未转染组减少(PV0.01),同时,电 子显微镜下,干扰组内膜结构较未转染组规则、平整,增生较轻。结论1、设计.合成了一个针对IP-10的特异性RNA干扰核昔酸序列,成功构建了针对IP-10基因的SiRNA真核表达载体。2. SiRNA表达载体转染可有效抑制内源性基因表达,本研究中质粒 pSnencer2.0-U6-snP-10转染可有效抑制IP?10 mRNA和蛋白水平表达,并抑制血 管平滑肌细胞增殖。3、 体内实验中证实局部转染pSiIencer2.OU&siIP?10成功抑制了IP?10的表达, IP?10表达的下调减轻了内膜损伤后新生内膜过度增生。综上所述,IP?10在血管损伤后内膜增生过程中发挥了重要作用,通过小干 扰RNA技术沉默IP?10的表达可以抑制血管平滑肌细胞异常增生,从而减轻内膜 损伤后新生内膜过度增生。关键词:IP-10;内膜增生;平滑肌细胞;小干扰RNAInterference of IP-10 inhibit vascular smooth muscle cells proliferation and Vsacular re-stenosisMajor: SurgeryMaster Candidate: Hu LingyuSupervisor: Prof Hu ZuojunAbstractBackgroundRecurrent arterial narrowing (restenosis) is the major reason limiting the success of revascularization procedures. Restenosis is caused by a combination of processes, which is characterized by the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. IP-10, a member of the chemokine CXC family, is part of the early phase of inflammatory response under interferon-gamma stimulation Studies reported that the IP-10 had potential effects in promoting VSMC proliferation and migration. During the formation of atherosclerosis, the overexpression of IP-10 in vascular cells plays an important role in T cell activation and colonization, and IP-10 was highly expressed in endothelium cells, smooth muscle cells and macrophages of the atheromatous plaque. Nevertheless, the role of IP-10 in the VSMC proliferation remains to be elucidated. We hypothesized that IP-10 directly stimulates VSMC proliferation, and the inhibition of IP-10 expression can suppress the aberrant proliferation of VSMC and overproliferation of vascular intima.ObjectiveVascular smooth muscle cell (SMC) proliferation rqpresents a pivotal event underlying intimal hyperplasia, a phenomenon impairing the long ter
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