western-blot 通用配方

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1.Western Blotting 相关溶液及抗体1) 转膜缓冲液(running buffer)(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸 144g不调pH转膜工作液(1×)(1L)(现配现用) (10×)转膜缓冲液(running buffer) 100ml 无水乙醇 100ml 水 800ml2) TBS 缓冲液(5×)(1L) Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4(约5ml浓盐酸,pH试纸检测即可)TBST:TBS+Tween-20 0.1%(1ml for 1L)3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine) 4) Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5) Western Blotting 第二抗体 辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤(1)SDS-PAGE 电泳分离蛋白质:(浓缩胶 70V,30-40min;分离胶 120V,1h)12%分离胶配方:5ml10ml15ml水1.63.34.930%丙烯酰胺2461.5M Tris pH8.8 1.32.53.810% SDS0.050.10.1510% 过硫酸铵(最后加)0.050.10.15TEMED0.0020.0040.0065%浓缩胶1ml2ml3ml4ml水0.681.42.12.730%丙烯酰胺0.170.330.50.671.0M Tris pH6.8 0.130.250.380.510% SDS0.010.020.030.0410% 过硫酸铵(最后加)0.010.020.030.04TEMED0.0010.0020.0030.0045×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油 1ml 10%(w/v)SDS 0.8ml?-巯基乙醇 0.2ml(2)将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形(3)配(1×)转膜工作液 (10×)转膜缓冲液(running buffer) 80ml 无水乙醇 80ml 水 640ml 800ml(4)将胶泡在(1×)转膜工作液中(防止胶干掉,最好不要用水,水泡胶会涨)(5)用尺子量胶大小,裁PDVF膜(不要用手蹭膜,手上有蛋白)(6)PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到(1×)转膜工作液中。(PDVF膜为疏水性的,先在乙醇中泡会使其亲水性好)(7) 将海绵和滤纸在水中浸湿,然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干):白板 — 海绵 — 两层滤纸--PDVF膜(靠正极)--胶(靠负极)(用小试管排气泡)--两层滤纸—海绵(用小试管排气泡)--夹住—放入胶槽中(白板靠红,黑板靠黑,保证电极方向不要错)--在胶槽中加入转子—倒入(1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V~100V恒压,60min(该条件可以转移25kD~90kD的蛋白)(8)封闭:在封闭液中室温,摇1h或者4℃静置过夜。(9)漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟;(10)一抗:适量的一抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine) 室温摇1h.(11) 漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟(12) 二抗:适量的二抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine) 室温摇1h.(13)漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟两种显带方式:曝光法(14)用纸将PVDF 膜上的水分吸干,然后将将PVDF 膜放在保鲜膜上,将ECL试剂盒中的A液和B液按照1:1的比例混匀(见说明书)后均匀覆盖到PVDF 膜上1min,然后用纸将PVDF 膜上的溶液吸干,放入X光片的暗盒中。(15)在暗室中,使用红光灯,将显影液,水,定影液分别倒入三个盘子中,然后取出X光片剪成合适大小,放入含有PVDF 膜的暗盒中,曝光一定时间后取出X光片,放入显影液中显影,检测显影的情况,当发现X光片中有条带时,放入水中清洗光片,然后在定影液中定影。然后在黑暗情况下将光片和显影液定影液收好。显影液和定影液应为无色透明,若发现颜色异、有沉淀或长菌需重配。 膜上显色法:(14)增强型HRP-DAB底物显色试剂盒;包括1×HRP缓冲液,试剂A,试剂B和试剂C,三者添加的体积比为1ml 1×HRP 缓冲液 + 50μl 试剂A + 50μl 试剂B + 50μl 试剂C。显色剂体积依照个人的需要配置。将PDVF膜置于显色剂中,暗处静置8-10min,接着用水冲洗以终止反应,然后将纸吸干PDVF膜上残余的水,扫描仪扫图即可。
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