三七不同部位总皂苷溶血性及体外免疫活性研究.doc

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?三七不同部位总皂苷溶血性及体外免疫活性研究  摘要:通过常规正丁醇法提取,大孔树脂层析分离纯化得三七总皂苷;通过溶血试验测定红细胞溶血率;脾淋巴细胞增殖试验测定三七不同部位总皂苷的生物免疫活性。结果表明,三七不同部位总皂苷溶血性较小,且均能显著促进ConA和LPS诱导小鼠淋巴细胞增殖反应,其免疫增强作用以三七主根总皂苷的效果较好。表明三七不同部位总皂苷安全性好,能促进细胞免疫和体液免疫。   关键词:三七总皂苷;生物免疫活性;溶血性;脾淋巴细胞增殖反应   中图分类号:R392 文献标识码:A 文章编号:0439-811423-4905-03     。樱簦酰洌 on Hemolytic Characteristics and Immunocompetence of Different Parts of  。校幔睿幔 notoginseng      LIANG Yong,QIN Feng,TANG Xiao-lei        。粒猓螅簦颍幔悖: Panax notoginseng saponions was purified by conventional butanol extraction and macroporous resin chromatography. Erythrocyte hemolysis rate was determined by hemdytic test, PNS biological immune activity from different parts of P. notoginseng was measured by spleen lymphocyte proliferation test. Results showed that hemolytic characteristics of different parts of P. notoginseng were smaller, and could significantly promote lymphocyte proliferation induced by ConA and LPS, and immune enhancement to the effect of total saponins of P. notoginseng root was better. The study showed that the security of PNS from different parts of Panax notoginseng was good, and could promote cellular and humoral immunity.  。耍澹 words: Panax notoginseng saponions; biologic immunocompetence; hemolytic characteristics; splenocyte proliferation   中药三七来源于五加科植物三七F.H.Chen),主产于我国广西云安,为我国特产的传统珍贵中药材。三七主根习称“头子”,支根习称“筋条”。三七总皂苷是三七的主要生理活性成分,具有扩张血管、降低心肌耗氧量、延长凝血时间、调节免疫等药理作用。三七总皂苷在高等动物的消化道中不能被吸收,故口服无溶血毒性,但其注射剂应用于临床有很小的溶血性,故研究皂苷的溶血性对临床用药安全性评价有很大的作用。目前三七总皂苷在免疫领域的研究较少,三七不同部位总皂苷的免疫活性研究基本上还是空白[1]。本试验通过探讨不同部位总皂苷的溶血性和体外免疫活性,为PNS提取工艺的优化、分离纯化及临床合理用药等提供一定的参考。  。 材料与方法  。保 材料与仪器   三七药材、三七筋条药材,均购于泰州医药公司;TU-1800紫外可见分光光度计;BP211D电子天平;RE-3000旋转蒸发仪;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵;TGL-16G型高速离心机;黄芪多糖:本实验室制备,含量大于60%;D101大孔吸附树脂;RPMI 1640细胞培养液;全自动酶标仪。其他试剂均为分析纯。普通级新西兰兔,18~22 g重的 ICR小鼠,均购自扬州大学畜牧医学院动物实验中心。  。保 方法  。保玻 总皂苷的提取、分离[2] 称取药材三七筋条粗粉,以体积分数70%的乙醇回流提。炒,每次2 h,过滤,合并滤液,减压回收乙醇,浸膏加适量水混悬,用正丁醇萃取至正丁醇液近无色,合并萃取液,减压回收正丁醇,得粗制三七筋条总皂苷。粗制皂苷用蒸馏水溶解,经D101大孔吸附树脂柱色谱除去糖类水溶性杂质,然后以体积分数95%的乙醇洗脱,合并洗脱液,减压回收乙醇,并浓缩至干,得精制三七筋条总皂苷。三七主根总皂苷的制备工艺同上。   取上述2种皂苷适量,以生理盐水溶解制成质量浓度为4 mg/mL的溶液,并以0.22 μm微孔滤膜滤过除菌,备用。  。保玻 红细胞悬浮液的制备[3] 取新西兰兔1只,心脏取血15 mL,置于盛有玻璃珠的三角瓶中,轻轻振。保 min, 去除纤维蛋白。将去纤维蛋白血加入10倍量血球稀释液, 混匀后以2 500 r/min离心5 min,弃上清液,再加入血球稀释液离心,反复3 次,至上清液呈无色透明液体,以血球稀释液稀释制备体积分数为2% 的红细胞悬液备用。  。保玻 供试品溶液的制备 精密称。叮 ℃下干燥至恒重的ZG及JT粉末,用生理盐水定容至50 mL容量瓶中,作为供试品溶液。  。保 溶血率测定[4]   取供试品溶液,用0.45 μm微孔滤膜过滤后,分别用生理盐水稀释,制成浓度为0.004~8.192 mg/mL 共12个浓度系列,每种样品各8个浓度梯度,并设4次重复。各。 mL不同浓度供试品溶液,分别加2 mL 2%红细胞悬浮液于试管中,并以生理盐水和蒸馏水分别做最大和最小溶血对照。将上述各试管置37 ℃恒温水浴锅培养1 h后,离心,取上清,在412 nm处测定吸光度,记录结果。   溶血率按下式计算:   溶血率=/×100%   式中,Amax为阳性对照蒸馏水作用组的吸光度;A0为生理盐水作用组吸光度;Ai为不同浓度的皂苷作用时测得的吸光度。  。保4 体外小鼠脾淋巴细胞增殖试验[5]  。保4.1 脾细胞悬液制备 无菌条件下取小鼠的脾脏,加适量Hanks液研磨,以200目不锈钢网过滤,1 500 r/min离心5 min,弃上清液,加Hanks液重复洗涤2次。收集脾细胞,加适量RPMI1640培养液稀释。
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