七种水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析.doc

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?七种水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析  摘要:采用垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对我国7种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析。结果表明,7种水蛭组织细胞中可溶性蛋白的SDS-PAGE图谱中多数条带相同,但也存在差异。其中日本医蛭蛋白条带最多,达28个,并且吸血蛭类的蛋白条数要明显大于非吸血蛭类,而3种不同地理分布的菲牛蛭间表达蛋白图谱无明显差异。该研究为在分子水平分析我国水蛭不同种类、同种不同地理分布及不同食性间的差异积累了新的生物学数据,对其分类和药材鉴别提供了参考依据。   关键词:水蛭;可溶性蛋白;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳   中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:0439-811416-3423-03      Analysis of Soluble Proteins in Histiocyte of Seven Leech Species by SDS-PAGE     。祝粒危 Bo1,ZHANG Bin2,GONG Yuan3,YU Xiang4,L??B Jun-yi5        。粒猓螅簦颍幔悖: The histiocyte soluble proteins of seven leeches in China were analyzed through SDS-PAGE. The results showed that the seven leech species shared most of the soluble proteins components of histiocyte; while a few differences existed. Hirudo nipponia Whitman had the largest number of protein bands of 28. There were more protein bands of blood-sucking leeches than that of non-bloodsucking leeches. No significant difference was detected among the histiocyte soluble proteins components of H. manillensis Lesson from three different areas. It was proved that SDS-PAGE could be used for classification and identification of leeches of different varieties, geographic distribution and food habit at the molecular level, and it accumulated data base of biologicalproperty.  。耍澹 words: leech; soluble-protein; SDS-PAGE      水蛭具有医用价值,其药效在《神农本草经》中就有记载,它有破血、逐瘀、通经的功效,主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤[1]。水蛭种类繁多,全世界记载命名的有680多种,其中我国有记录的蛭类就达100余种[2,3]。我国有医用价值的蛭类主要集中在医蛭形亚目的医蛭科、黄蛭科和山蛭科[1,4]。我国最新药典规定的药用水蛭有3种:蚂蟥、柳叶蚂蟥、水蛭,它们分属于黄蛭科和医蛭科[5]。在国内水蛭药材市场,一般通过形态学特征加以鉴定,易造成人为的误判,因此有必要通过理化和分子手段来进行水蛭药材的辅助鉴别。目前,有通过薄层层析和蛋白电泳方法来对历版药典收录的3种水蛭炮制品进行鉴别的报道[6-8],而针对水蛭活体的鉴别研究仅有关于日本医蛭和天目山蛭4种同工酶蛋白电泳比较研究的报道[9]。试验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对我国7种不同食性和地理分布的水蛭活体组织细胞可溶性蛋白表达特征及差异进行了分析,为水蛭资源分析、种类鉴定和种类间遗传多样性分析提供一定参考。  。辈牧嫌敕椒  。保笔匝椴牧   宽体金线蛭和光润金线蛭产于江苏省宿迁市,尖细金线蛭产于山东省鱼台县,日本医蛭产于湖北省公安县,3种野生菲牛蛭分别产于广东省清远市、广西壮族自治区钦州市和海南省琼中县。  。保彩匝槭约   丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、SDS和β-巯基乙醇等购自Sigma公司;过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、Tris碱、溴酚蓝、冰醋酸和考马斯亮蓝R-250等购自广州威佳生物科技有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。  。保车鞍籽分票讣按炕  、倩钐逅蔚臀麓λ篮蠼涑Φ婪,用去离子水洗净内容物,把组织剪切成细小的碎末,用研钵在液氮条件下将样品研磨成细粉末状[9];②取适量RIPA裂解液,在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟,使其最终浓度为1 mmol/L;按每20 mg组织加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液;③用玻璃匀浆器匀浆至充分裂解后,将组织悬液在4 ℃,8 000 r/min离心10 min;④小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心后的上清液,在4 ℃,15 000 r/min离心10 min;⑤吸取离心的上清液,分装于1.5 mL的离心管,即为电泳样品,置于-80℃下保存;用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。  。保此巫橹赴扇苄缘鞍鬃榉郑樱模樱校粒牵诺缬
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