基因工程复习资料(精简版).doc

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?名词解释1、基因工程:按照人的意愿,由将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去,将DNA重新组织一下,设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型,这种的生物科学技术,就称为“基因工程”,或者说是“遗传工程”。2、基因:是遗传的物质基础,基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。3、基因治疗:是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织,通过替换或补偿引起疾病的基因,或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。4、操纵子: 原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起,转录生成一个mRNA,然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶,或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子,操纵基因共同构成转录单位,称操纵子。5、启动子: 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件,包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时,将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。6、基因表达:是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。7、管家基因:某个基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为管家基因。8、质粒(plasmid):是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细胞质中,质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状,如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性,与细菌的遗传变异有关。质粒有严紧型和松弛型两种类型,在克隆基因中常用的是松弛型,在表达研究中常用的是严紧型。9、穿梭质粒:既能在大肠杆菌中复制,又能在酵母菌中复制和表达的质粒。10、质粒的不亲和性(质粒的不相容性):在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定的共存。11、DNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,即DNA克隆。 12、基因文库: 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断,并将所有这些片断都与适当的载体连接,引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,称为基因文库。13、cDNA文库:从组织细胞中分离得到纯化的mRNA,然后以mRNA为模板,利用逆转录酶合成其互补DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后导入受体菌内进行保存和扩增,称cDNA文库。14、电泳迁移率:带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动,速度称为电泳迁移率。15、半保留复制:DNA在复制过程中首先碱基间氢键破裂并使双链解螺旋分开,然后两条链各作为摸板在其上合成新的互补链,结果由一条链可以形成互补的两条链。这样所形成的两个DNA分子的碱基顺序完全一样,在此过程中,每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的,这种复制方式为半保留复制。16、SD序列:mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。17、RFLP:RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异,这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。18、分子杂交 :有一定同源性的两条核酸单链,在适宜的温度和离子浓度等条件下,通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。19、碱抽提法:提取质粒DNA的一种方法,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质—SDS复合物结合在一起,还有大肠杆菌基因组DNA在离心的时候沉淀下去,而质粒DNA在变性后,很快复性,因此可以提取质粒DNA。20、基因扩增(gene amplification):生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有5种方式,环境诱发扩增,基因的程序性扩增 基因组进化扩增,基因工程扩增,PCR扩增。21、限制性核酸内切酶:是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列(4—8bp),并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。识别位点的序列相同的限制性内切酶称为同裂酶;识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端的限制性内切酶称为同尾酶。22、DNA 多态性 (DNA polymorphism):在正常人群中,各个体DNA 分子的某些位点可以发生中性改变,这些改变虽然会使DNA 一级结构产生一定变化,但不影响基因的表达,如果这种中性突变在人群中的频率不低于1%,这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体DNA 中核苷酸数目或排列顺序的个体差异,这些差异多数为中性突变,不引起表型改变。23、不完全酶切:限制性核酸内切酶对DNA的消化不十分完全,只有有限数量的酶切位点被切开,可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。24、DNA连接酶(ligase):把两条DNA双链连接到一起的酶,主要有两种DNA,一种只能连接粘性末端,一种不但能连接粘性末端还能连接齐平末端。25、RNA干扰(RNAi):是指对应与某种mRNA的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)分子使mRNA发生特异性降解,导致其不能表达的转录后基因沉默现象。26、密码的简并性:由于4种核苷酸可以代表64种氨基酸,因此大多数氨基酸都可以具有好几组密码子。27、基因敲除:利用同源重组的原理,通过载体将外源的失活的基因替换掉内源的正常的基因,从而使基因沉默而不表现突变性状的方法。简答题1、基因工程的基本步骤第一步:获取目的基因:直接分离或人工合成。即获取含有所需要的完整的遗传信息的DNA片段。第二步:目的基因与载体结合:用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口处,让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后,在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。第三步:目的基因的导入和表达:通过载体把目的基因带入某生物体内,并使目的基因在受体细胞内能准确地转录和翻译。第四步:目的基因的检测和表达:将每个受体细胞单独培养形成菌落,检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落,保留有表达产物的进一步培养、研究。2、简述获得目的基因常用的几种方法。(1)直接从染色体DNA中分离:仅适用于原核生物、叶绿体和线粒体基因的分离,较少采用。 (2)人工合成:根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。省略部分。需要延长C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶,会将你的产物降解,也可能因为修饰系统不同,使得产物的活性不高或者没有。E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达.19、原核表达系统的注意事项 1)外源基因不能带有内含子。 2)必须用cDNA 3)不能直接用真核基因组DNA。 4)必须利用原核细胞的调控原件(启动子等) 5)防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。 20、提高表达水平常用的方法1)选择强启动子序列,如tac 等 2)调整S-D序列与AUG碱的距离:一般为5-9bp。 3)改变起始密码下面的几组密码子 4)增加mRNA的拷贝数和稳定性:在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’?5’外切酶的攻击。 5)减轻宿主细胞的代谢负荷:合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 6)提高表达产物的稳定性 :防止被宿主的酶降解。(1)设计成融合蛋白(2)使用突变菌株,;ね庠吹鞍撞槐唤到猓3)表达分泌蛋白论述题1、论述利用微生物生产药物的优越性何在?所谓利用微生物生产蛋白质类药物,是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因,构建成表达载体后导入微生物,然后利用微生物发酵来生产蛋白质类药物。 优越性:(1)利用活细胞作为表达系统,表达效率高,无需大型装置和大面积厂房就可以生产出大量药品。(2)可以解决传统制药中原料来源的不足。(如,生长素是治疗侏儒症患者的药物,治疗一名侏儒症患者每年需要从80具尸体的脑下垂体中提取生长素。利用基因工程菌发酵生产就不需要从动物或人体上获取原料。 (3)降低生产成本,减少生产人员和管理人员。2、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点?同:①原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质,可降低对流运动,故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下,DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。 ②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小;浓度越高,空隙越小,其分辨能力也就越强;反之,浓度降低,空隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。 异:琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间;而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp,分离小片段效果最好,分辨率极高,相差1bp的DNA也可分开。3、试比较Southern杂交、Northern杂交和Western杂交的相同点与不同点。Southern blot,Southern印迹转移试验(Southern blot)又称凝胶电泳压印杂交技术,是Southern 于1975 年建立的一种DNA 转移方法。该法利用硝酸纤维素膜或经特殊处理的滤纸或尼龙膜具有吸附DNA 的功能,先作DNA 片段的凝胶电泳,并将凝胶电泳中的DNA 区带吸附到膜上,然后直接在膜上进行同位素标记核酸探针与被测样品之间的杂交,再通过放射自显影对杂交结果进行检测。Northern blot,Northern 吸印杂交试验(Northern blot) 又称为 RNA 印迹法,是对应于Southern blot 而命名的。它的特点是电泳结果为RNA 图谱而不是DNA 图谱,即是将RNA 样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到硝酸纤维素滤膜上,用同位素或生物素标记的DNA 或RNA 特异探针针对固定于膜上的mRNA 进行杂交,洗脱除去非特异性杂交信号,对杂交信号进行分析,以确定目的基因的表达组织。Western杂交: Western blot 是指经过 SDS-PAGE 分离(聚丙烯酰胺凝胶电泳)的蛋白质样品,转移到固相载体(如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性的目的基因的表达的蛋白成分。相同点:杂交流程相同,探针种类和标记方法相同,检测方法相同。不同点:原理不同, Southern杂交和Northern杂交是核酸分子杂交,而Western杂交是抗原抗体反应。杂交对象不同: Southern blot 是与酶切后电泳的DNA 片段杂交,Northern blot 是与电泳后的RNA杂交, Western杂交是与膜上的蛋白质杂交。检测目的不同: Southern blot是检测目的基因的序列正确否或目的基因有无导入到受体细胞,Northern blot和Western杂交是检测目的基因的表达情况。4、肿瘤的产生可能是抑癌基因突变或表达失误造成,也可能是原癌基因突变或表达失误造成。对肿瘤患者进行基因治疗时,应该采取哪些策略? 1)增强机体对肿瘤细胞的免疫能力2)植入敏感或自杀基因到肿瘤细胞。所谓自杀基因治疗,就是将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞,通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物,以达到杀死肿瘤细胞的目的。3)阻断癌基因的表达,主要用反义RNA法,RNA干涉技术,核酶技术等,如Myc基因的反义RNA片段。4)应用肿瘤抑制基因如p53。人类恶性肿瘤中p53基因突变率较高,用野生型的p53基因治疗肿瘤在模型动物上取得了显著的成功。5)诱导正常组织产生抗肿瘤物质6);ふW橹馐芑频挠跋歙D―耐药基因治疗。多药耐受MDR是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时,也对其他结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。耐药基因治疗是指将一些耐药基因转移至造血干细胞,以降低化疗药物对骨髓的毒性,这样就可以用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。7)抑制肿瘤血管生成。肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质,没有血管的生成,肿瘤最大也只能长至1-2mm3。通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长,防止肿瘤的转移。VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中的一个重要的调节因子,它可选择性刺激内皮细胞分裂,并能增加微血管的通透性。通过阻断VEGF的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。如引入反义VEGF的cDNA基因,通过与VEGF的mRNA结合,来抑制VEGF蛋白的翻译。5、质粒转化原理,影响转化率的因素有哪些?化学法(CaCl2法)转化原理:是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,质;駾NA重组分子便可进入细胞内(感受态细胞)。电穿孔转化转化原理:将待转化的质;駾NA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中,两极施加高压电场,在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,质;駾NA重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素:1)载体本身的性质及其空间构象:超螺旋构象转化率最高;2)插入片段的大小:插入片段越大,转化效率越低;3)受体细胞的类型及预处理;4)转化方法:电击法高于化学法。
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