中华绒螯蟹颤抖病螺原体分布及16 S-23 S rRNA基因间隔区序列的分析.doc

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?中华绒螯蟹颤抖病螺原体分布及16 S-23 S rRNA基因间隔区序列的分析  摘要:为了探究中华绒螯蟹颤抖病螺原体在江苏省的分布,以2003年至2009年从江苏省养殖池塘收集的发病中华绒螯蟹为研究对象,利用螺原体体外培养、光电镜检测和16 S-23 S rRNA基因间隔区序列比较等方法进行了系统分析。结果表明,S. eriocheiris是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物,它们不仅在7月底8月初的高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡,还能在3月和11月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡,其严重:χ泄帐≈谢掾费骋档慕】捣⒄。   关键词:中华绒螯蟹;中华绒螯蟹颤抖病螺原体;16 S-23 S rRNA基因间隔区序列   中图分类号:S966.16;S945.19文献标识码: A文章编号:0439-811417-3632-03     。模椋螅簦颍椋猓酰簦椋铮 and 16 S-23 S rRNA Intergenic Region Sequence Analysis of  。樱穑椋颍铮穑欤幔螅恚 eriocheiris     。龋眨粒危 Ying,YE Xin,HU Chuang-xian,BI Ke-ran        。粒猓螅簦颍幔悖: In order to explore the distribution of Spiroplasma eriocheiris, a novel pathogen which causes tremor disease of Chinese mitten crab, in Jiangsu province, diseased crabs were collected from 2003 to 2009 in Jiangsu province. In vitro culture of spiroplasma pathogen, optical microscopy detection and 16 S-23 S rRNA intergenic region sequence comparison were adopted for analysis. The results showed that S. eriocheiris was a widely distributed pathogenic microorganism in Jiangsu, which caused morbidity and mortality of Chinese mitten crab not only in hot seasons of March and November, but also in cool seasons, thus it was a serious threat for crab breeding industry in Jiangsu province.  。耍澹 words: Chinese mitten crab ; Spiroplasma eriocheiris; 16 S-23 S rRNA intergenic region sequence      中华绒螯蟹是中国特有的水产养殖珍品,具有重要的经济价值。随着其养殖的集约化和规;⒄,各种病害已经成为:ρ芬档闹卮竽烟。在中华绒螯蟹众多病害中,颤抖病是最为常见、:涎现氐囊恢,有的地方发病率高达90%以上,死亡率达80%~100%,发病严重的养殖池塘甚至出现绝产,损失极其惨重。为解决该类疾病问题,研究人员围绕其病因、病原、致病机理、防治措施等方面开展了大量研究。2004年,Wang等[1]发现引起中华绒螯蟹颤抖病的主要病原是螺原体而非病毒、类立克次体、真菌或其他的环境因子。之后,他们对中华绒螯蟹颤抖病螺原体的病原形态学[2]、免疫血清学[3]和分子生物学[4]等进行了深入系统的研究,证实中华绒螯蟹颤抖病螺原体是螺原体属的一个新种,被命名为Spiroplasma eriocheiris[3]。本研究以江苏省患颤抖病的中华绒螯蟹为对象,对该病螺原体在江苏省的分布及其16 S-23 S rRNA基因间隔区序列特征进行分析,以了解中华绒螯蟹颤抖病螺原体感染的现状,为中华绒螯蟹颤抖病的科学防治提供理论依据。  。辈牧嫌敕椒  。保北瓯镜牟杉痛  。玻埃埃持粒玻埃埃鼓晔占皇、无力、步足颤抖的患病中华绒螯蟹,采集病蟹的池塘分布在江苏。玻哺龅厍,分别是南京、高淳、句容、六合、苏州、昆山、宜兴、扬州、金坛、溧阳、镇江、兴化、中港、公民、金湖、高邮、泗洪、洪泽、宝应、宿迁、一场和天平,其中宝应县的病蟹采自3月和11月,其他21个地区的病蟹均在7、8月采集。采集的病蟹用保温盒低温运送到实验室。  。保仓谢掾凡恫÷菰宓姆掷牒托翁鄄   垂死的中华绒螯蟹用75%乙醇进行体外消毒,用高压灭菌的解剖器皿进行解剖。取约0.2 g的腹肌放在无菌称量纸上剪碎,碎屑转移到2 mL灭菌PBS缓冲液中,室温静置1 h后在超净台内用孔径0.22 μm的滤器过滤,得到中华绒螯蟹肌肉组织匀浆液。取组织匀浆液50 μL接种至1 mL R2液体培养基中[5],30 ℃恒温培养箱培养,逐日观察培养基颜色变化。当培养至对数生长期时,取螺原体菌液0.01 mL置Nikon相差显微镜下观察螺原体的螺旋形态及运动特性。同时取少许对数期螺原体菌液与4%戊二醛溶液等体积混合均匀,4 ℃固定2 h,吸混合液少许置Formvar包被的铜网上,1 min后用滤纸吸干,随即加上一滴2%磷钨酸钠溶液作用30 s左右,然后用滤纸吸干。负染后的铜网于干燥器内干燥后用日立H-600型透射电镜观察并拍摄螺原体的形态。  。保持谢掾凡恫÷菰寤蜃椋模危恋奶崛   取病蟹肢。埃 g,在低温石蜡板上切碎,转移至1.5 mL 离心管中,加入5% Chelex100螯合树脂混匀液150~200 μL,震荡混匀后加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K溶液,漩涡器振荡10 s,使充分接触后,56 ℃,恒温金属浴消化1.5~2.0 h;待裂解液由混浊变澄清后取出置漩涡器充分振荡10 s,99 ℃恒温金属浴孵育8 min;取出漩涡振荡器充分振荡数秒,13 000 r/min 离心4 min,取上清液于另一支灭菌1.5 mL离心管中,-20 ℃保存。  。保粗谢掾凡恫÷菰澹保 S-23 S rRNA基因间隔区序列的扩增   使用引物扩增中华绒螯蟹颤抖病螺原体的16 S rRNA基因、23 S rRNA基因和16 S-23 S rRNA基因间隔区序列,引物序列为16F2:GGTGCATGGT
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23 16 rrna 分布 基因 原体 间隔 颤抖 绒螯蟹 序列
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